USPTO Patents Application 10561839

<J9) BUNDESREPUBLIK <§) Offenlegungsschrift

D E UTS CH LAND

DEUTSCHES
PATE NTAIWT

®

DE 4132379 A1

(5T) Aktenzeichen:
(3) Anmeldetag:
@ Offenlegungstag:

P41 32 379.3
28. 9.91
8. 4.93

(g) Int. CI. 5 :

C 12 M 3/00

G 02 B 21/34
C 12 N 11/08
//C12Q 1/18,1/00.
C12N 5/06, C08J
5/18.C08L 33:12

<

CO

CM
CO

LU

(7?) Anmelder:

Kernforschungszentrum Karlsruhe GmbH, 7500
Karlsruhe, DE

@ Erfinder:

Weibezahn, Karl Friedrich, Dr., 7513 Stutensee, DE;
Knedlitschek. Gudrun, Dr., 7500 Karlsruhe. DE;
Dertinger. Hermann, Prof. Dr., 6900 Heidelberg. DE;
Schubert, Klaus, Dr., 7500 Karlsruhe, DE; Bier,
Wilhelm, Dr., 7514 Eggenstein-Leopoldshafen, DE;
Schaller, Thomas, 7504 Weingarten, DE

Prufungsantrag gem. § 44 PatG ist gestellt

@ Substrat fur Zellkulturen und Kultur von Zellen oder Zellaggregaten

@ Die Erfindung betrifft ein Substrat fur Zellkulturen, baste-
hend aus einem mikrostrukturierten plattenformigen Korper,
der zur Aufnahme von Zellen oder Zellaggregaten eine
Vielzahl von durch Stege voneinander getrennte Vertiefun-
gen enthalt, deren groBter Durchmesser und deren Tiefe
jeweils ein Mehrfaches des Durch messers der Zellen oder
Zellaggregate betragt und die an ihrem Grund jeweils
mindestens eine Offnung aufweisen. die kleiner ist als die
kleinste der von den Vertiefungen aufzunehmenden Zellen
oder Zellaggregaten sowie eine mit diesem Substrat ange-
legte Zellkultur. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde.
ein Substrat vorzuschlagen, mit dessen Hilfe eine dreidimen-
sionale Zellkultur angelegt werden kann.

CO

CM
CO

BUNDESDRUCKEREI 02. 93 308 014/1 15

12/59

DE 41 32 379 Al

l

Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Substrat fiir Zellkulturen,
bestehend aus einem mikrostrukturierten plattenformi-
gen Korper, der zur Aufnahme von Zellen oder Zellag- 5
gregaten eine Vielzahl von durch Stege voneinander
getrennte Vertiefungen enthalt, deren groBter Durch-
messer und deren Tiefe jeweils ein Mehrfaches des
Durchmessers der Zellen oder Zellaggregate betragt
und die an ihrem Grund jeweils mindestens eine Off- 10
nung aufweisen, die kleiner ist als die kleinste der von
den Vertiefungen aufzunehmenden Zellen oder Zellag-
gregate sowie eine dreidimensionale Kultur von Zellen
oder Zellaggregaten mit einem Substrat in Form einer
Gitterstruktur mit wabenartig angeordneten, durch 15
Stege mit zur Gitterebene senkrechten oder geneigten
Wanden getrennten Durchbruchen, deren Durchmesser
und Tiefe ein Mehrfaches des Durchmessers der Zellen
oder Zellaggregate betragt, wobei die Zellen oder Zel-
laggregate an den Wanden der Stege haften. 20

Aus der Veroffentlichung "Morphologische Untersu-
chungen an Eileiterepithelzellen des Kaninchens: Pri-
markulturen auf Polycarbonatmembranen" von I. G.
Noske in TECNOMARA NEWS IV/90, Labortechni-
sche Informationsschrift ist ein zweidimensionales Sub- 25
strat fiir Zellkulturen und eine zweidimensionale Zell-
kultur bekannt. Das Substrat besteht aus einer Mem-
bran, die Poren unterschiedlicher GroBe aufweist. Eini-
ge dieser Poren durchdringen die Membran. Die Zellen
zeigen eine Tendenz, sich in diesen Poren zu verankern. 30
Im wesentlichen bildet die Zellkultur eine Monoschicht,
die die Oberseite und die Unterseite der Membran be-
deckt.

Solche Substrate haben den Vorteil, daB Nahrlosung
den Zellen ungehindert zugefuhrt und Stoffwechselpro- - 35
dukte leicht abtransportiert werden konnen. Ferner be-
steht die Moglichkeit, auf solchen Substraten haftende
Zellen optisch unter dem Mikroskop zu kontrollieren.
Als Fazit der Veroffentlichung ist jedoch angefiihrt, daC
die Zellen sich in Abhangigkeit vom angebotenen Sub- 40
strat in ihrer Form verandern. So wachsen sie auf Glas-
oder Plastikunterlage oft extrem flach, so daB die fur
ihre Funktion so wichtige Polaritat nicht gewahrleistet
ist.

Aus den Veroffentlichungen "Solid tissue masses for- 45
med in vitro from cells cultured on artificial capillaries"
von Richard A. Knazek, Federation Proceedings Vol. 33,
No. 8 (August 1974) und einem Firmenprospekt der Fir-
ma "dunn Labortechnik GmbH" in Asbach, DE. mit dem
Titel "Cellmax™ 100 — Hollow Fiber Bioreactor Sy- 50
stem for Mammalian and Insect Cell Culture", der auf
die Veroffentlichung Knazek bezug nimmt, ist ein Zell-
substrat bekannt, das aus einer Vielzahl parallel verlau-
fender Kapillaren besteht, die im Abstand voneinander
angeordnet sind. Die Kapillaren sind an ihren Enden 55
durch jeweils ein AbschluBstuck zusammengefaBt, mit
dem Nahrlosung durch die Kapillaren geleitet werden
kann. Die Zellen wachsen an der AuBenseite der Kapil-
laren in dem Zwischenraum, den sie untereinander bil-
den, auf. Die Nahrlosung diffundiert aus dem Innern der eo
Kapillaren durch die Kapillarwand in den Zwischen-
raum und versorgt hierdie Zellen. Auf diese Weise kann
eine dreidimensionale Zellstruktur erzeugt werden.

Dieses Substrat erscheint aus verschiedenen Grunden
zur Anlage und Untersuchung von Zellkulturen weniger 65
geeignet. Der Stoffwechselgradient ist wegen der unre-
gelmaBigen Geometrie nicht eindeutig definiert. Ferner
wird die Diffusion von Produkten durch die Konstruk-

tion der verschiedenen Kapillaren in Abhangigkeit vom
verwendeten Material immer auf bestimmte Molekular-
gewtchte eingeschrankt. Fur manche Anwendungen ist
eine Beschichtung des Substrats notwendig; eine solche
Beschichtung kann bei diesem Zellsubstrat als Diffu-
sionssperrschicht wirken und damit einen Gradienten
zusammenbrechen lassen. SchlieBlich kann das bekann-
te Substrat nicht so ausgebildet werden, daB eine mikro-
skopische Kontrolle der Zellen wahrend der Kultivie-
rung moglich ist.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde. den ge-
nannten Nachteilen der bekannten Zellsubstrate abzu-
helfen. Insbesondere sollen die Vorteile von membran-
artigen Substraten mit der Moglichkeit, dreidimensiona-
le Zellstrukturen ausbilden zu konnen, kombiniert wer-
den.

Die Aufgabe wird durch das eingangs beschriebene
Substrat fiir Zellkulturen und durch die eingangs be-
schriebene Zellkultur geldst. Die abhangigen Anspru-
che geben besonders vorteilhafte Ausfuhrungsformen
des Substrats an.

ErfindungsgemaB wird ein Substrat fur Zellkulturen
vorgeschlagen, das aus einem mikrostrukturierten plat-
tenformigen Korper besteht, der eine Vielzahl von
durch Stege voneinander getrennte Vertiefungen ent-
halt. Der groBte Durchmesser und die Tiefe der Vertie-
fungen wird so gewahlt, daB sie jeweils einem Mehrfa-
chen des Durchmessers derjenigen Zellen oder Zellag-
gregate entsprechen, fiir die das Substrat vorgesehen
ist. Die Vertiefungen weisen an ihrem Grund jeweils
mindestens eine Offnung auf, die kleiner ist als die klein-
ste der von den Vertiefungen aufzunehmenden Zellen
oder Zellaggregate, so daB die Zellen auf einfache Wei-
se in die Vertiefungen eingebracht werden konnen, in-
dem auf das Substrat von der Seite, die die groBen Off-
nungen aufweist, eine Zellsuspension aufgebracht wird.
Auf diese Weise werden die Zellen in den Vertiefungen
festgehalten und konnen sich an deren Wanden veran-
kern.

Das erfindungsgemaBe Substrat stellt vorzugsweise
einen plattenformigen Korper dar, der in der Art einer
Gitterstruktur beispielsweise quadratische Vertiefun-
gen enthalt, die dicht nebeneinander angeordnet sind
und sich in Form eines Pyramidenstumpfs nach unten
verjungen. Auf den Grundflachen der Vertiefungen sind
weitere, wesentlich kleinere pyramidenformige Vertie-
fungen angebracht, wobei die Spitzen der pyramiden-
formigen Vertiefungen den plattenformigen Korper
durchstoBen.

Eine weitere Ausfuhrungsform des erfindungsgema-
Ben Substrats besteht darin, daB eine gitterformige
Struktur auf eine mikroporose Bodenplatte aufgesetzt
ist. Hierbei ist es unerheblich, ob die Stege des Gitters
zur Gitterebene senkrecht oder geneigt angeordnet
sind. Als Bodenplatte kann eine fur Flussigkeiten durch-
tassige Membran verwendet werden, die die Zellen zu-
ruckhalt. Die Membran kann aus einem organischen
Polymer oder Copolymer bestehen; als Bodenplatte ist
jedoch auch eine keramische Fritte geeignet.

Eine Bodenplatte mit einer oder mehreren Offnun-
gen, die kleiner sind als die kleinste der von den Vertie-
fungen aufzunehmenden Zellen oder Zellaggregate, ist
nur anfangs notwendig, wenn die Zellkultur angelegl
wird. Nach einiger Zeit haften die Zellen an den Wan-
den der Vertiefungen und bilden gewebeartige dreidi-
mensionale Zellaggregate aus, wobei die Zellen mit den
an den Wanden haftenden Zellen aggregieren. Mikro-
skopische Untersuchungen konnen vereinfacht werden.

DE 41 32

3

wenn die Bodenplatte nach der Anlage der Zellkultur
vom Gitter gelost werden kann.

Als Werkstoffe fur das Substrat sind vor allem durch-
sichtige Materialien geeignet. Vorzugsweise besteht das
Substrat aus Polymethylmethacrylat (PMMA). Fiir den 5
Fall, daB das Substrat aus einem Gitter und einer vom
Gitter losbaren mikroporosen Bodenplatte aufgebaut
ist, reicht es aus, wenn nur das Gitter aus einem durch-
sichtigen Material gefertigt ist.

Das erfindungsgemaBe Substrat kann in einen Mikro- 10
skop-Objekttrager integriert werden.

Durch dreidimensionale Kultivierung der Zellen im
erfindungsgemaBen Substrat erfolgt Zelldifferenzie-
rung zusatzlich zu den Substratkontakten iiber Zell-zu-
Zell-Interaktionen. Neben der mikroskopischen Beob- 15
achtung konnen Serien-Dunnschnitte des mit Zellen ge-
fullten Substrates angefertigt werden, ein fiir die An-
wendung histologischer und histochemischer Methoden
entscheidender Vorzug.

Das erfindungsgemaBe Substrat kann in einen Ob- 20
jekttrager ebenso wie in ein Medium-Zirkulationssy-
stem integriert werden. Bei mehrlagiger randdichter
Ausfullung mit Zellen stellt das Substrat eine Art Gewe-
befilter dar, wodurch zwei physiologische Halbraume
oberhalb und unterhalb desselben definiert werden. 25
Durch unterschiedliche Mediumbeschickung im Zirku-
lationssystem bilden sich vertikal gerichtete Stoffwech-
selgradienten in der ICultur aus, die auch durch eine
zusatziiche Beschichtung der Gitterelemente (z. B. mit
Komponenten der Extrazellularmatrix im Zuge zellspe- 30
zifischer Anwendungen) nicht blockiert oder behindert
werden.

Das erfindungsgemaBe Substrat stellt eine stabile
Stutzstruktur fiir Zellen dar und ermoglicht die Herstel-
lung von definierten Schichten aus verschiedenen Zell- 35
typen. Durch die hierbei auftretenden heterotypischen
Zellinteraktionen kann es zu weiteren Differenzie-
rungssvorgangen kommen. Mit solchen Systemen kon-
nen beispielsweise zellspezifische Transportprozesse
studiert werden. Speziell konnten die in vitro nur 40
schwer restituierbaren Bedingungen des Organsystems
Haut naher untersucht werden, indem ein Halbraum
von Luft anstelle von Medium durchstromt wird.

Eine solche "organnahe" Kulturtechnik auf der Basis
des erfindungsgemaBen Substrates ist auf eine groBe 45
Zahl verschiedenartiger Zelltypen anwendbar. Sie kann
fiir Fragestellungen aus zahlreichen biomedizinischen
Gebieten eingesetzt -werden, bei denen ein HochstmaB
an Zelldifferenzierung erforderlich ist:

50

— Fur toxikologische Untersuchungen zur Erzie-
lung wirklichkeitsnaher Ergebnisse.

— Bei der Entwicklung von Arzneimitteln: Wir-
kungs- und Abbautests.

— In der Grundlagenforschung. 55

— Als Alternative zum Tierexperiment, vor allem
bei der Untersuchung komplizierter Organsysteme
(z. B. Leber oder Haut).

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Figuren
und Ausfuhrungsbeispielen naher erlautert.

Fig. 1 zeigt eine Ausfiihrungsform mit quaderformi-
gen Vertiefungen 1, die durch senkrechte Stege 2 von-
einander getrennt und nach unten durch eine porose
Bodenplatte 3 abgeschlossen sind.

Fig. 2 zeigt die Ausfiihrungsform gemaB Fig. 1 und
eine abgewandelte Ausfiihrungsform mit V-formigen
Stegen im Querschnitt.

379 Al

4

Die Fig. 3 bis 5 zeigen verschiedene Bearbeitungs-
schritte eines Formeinsatzes, mit dem eine Ausfiih-
rungsform des erfindungsgemaBen Substrats abgeformt
werden kann.

Fig. 3 stellt den vorbearbeiteten Formeinsatz dar.
In Fig. 4 ist der grobstrukturierte Formeinsatz darge-
stellt.

Fig. 5 zeigt den feinstrukturierten Formeinsatz.
Fig. 6 zeigt mit dem grobstrukturierten Formeinsatz
abgeformte Stege aus PMMA.

Fig. 7 zeigt mit dem feinstrukturierten Formeinsatz
abgeformte Stege mit kleinen Einsenkungen am Grund
der durch die Stege gebildeten Vertiefungen, aus denen
die Offnungen hergestellt werden.

Fig. 8 zeigt die durch Frasen bearbeitete Unterseite
des Substrats mit den Offnungen.

Fig. 9 stellt die Oberseite des in Fig. 8 gezeigten Sub-
strats dar.

Fig. 10 zeigt einen Mikroskop-Objekttrager, in den
das Substrat integriert ist.

Fig. 1 1 zeigt einen weiteren Mikroskop-Objekttrager
mit integriertem Substrat.

Beispiel 1

Herstellung einer Ausfiihrungsform des
erfindungsgemaBen Substrats

Die erfindungsgemaBen Substrate konnen durch
Rontgenlithographie-Verfahren oder durch Abform-
verfahren hergestellt werden. Im folgenden wird an-
hand der Fig. 3 bis 8 ein Abformverfahren beschrieben,
mit dem auf einfache Weise eine Vielzahl der erfin-
dungsgemaBen Substrate in Serie hergestellt werden
konnen.

Zur Abformung eines Substrats aus Kunststoff wird
ein Formeinsatz benotigt, in den die Positiv-Strukturen
der Vertiefungen und Offnungen des mikrostrukturier-
ten Substrats eingebracht sind.

Fig. 3 zeigt einen vorbearbeiteten Formeinsatz mit
vier erhabenen Plateaus von 10 mm x 10 mm in den Be-
reichen 1 bis 4. Die Hone der Plateaus betragt 1 mm. In
jedes Plateau werden mit einem keilformig profilierten
Diamanten kreuzweise Nuten derart eingebracht, daB
im RastermaB 400 urn quadratische Netze aus 280 u.m
tiefen Graben mit dreieckigem Querschnitt entstehen.
Dadurch bleiben Pyramidenstumpfe mit Deckflachen
von 300 u. x 300 u,m stehen. Diese grobstrukturierte
Form des Formeinsatzes ist in Fig. 4 dargestellt.

Danach werden in den Bereichen 1 bis 4 in die Pyra-
midenstumpfe durch erneute kreuzweise Bearbeitung
mit feineren Diamanten eine Substruktur eingebracht:
Die DeckflSche eines jeden Pyramidenstumpfs wird im
Raster 40 u,m durch 8x8 Mikropyramidenstumpfe
strukturiert Die Hone der Mikropyramidenstumpfe
liegt bei 80jxm, die Deckflachen messen einige 10 urn 2 .
Das Ergebnis dieses Bearbeitungsschritts ist in Fig. 5
dargestellt.

Der auf diese Weise bearbeitete Formeinsatz wird
60 mit Hilfe einer SpritzgieBmaschine abgeformt. Fig. 6
und 7 zeigen Grob-und Feinstruktur des in PMMA ab-
geformten Werkzeugs.

In einem abschlieBenden Bearbeitungsschritt wird
das unter den abgeformten Strukturen befindliche Ma-
65 terial entfernt; durch diesen Schritt werden die Offnun-
gen am Boden des Substrats freigelegt. Hierzu wird das
Substrat auf einer Vakuumspannvorrichtung fixiert und
solange Material von der Unterseite des Substrats ent-

DE 41 32

5

fernt, bis die Offnungen bzw. Poren des Bodens offen
zutage treten. Ober das MaD des Abtrags laBt sich die
Dicke des Bodenteils und der minimale Porendurchmes-
ser steuern. Das Ergebnis dieses Verfahrensschritts ist in
den Fig. 8 (Unterseite des Substrats) und 9 (Oberseite 5
des Substrats) dargestellt. Wird der Boden des Substrats
vollstandig entfernt, laBt sich ein Kunststoffgitter aus
100 [im breiten Stegen mit Maschenweiten von 300 \im
herstellen.

10

Beispiel 2

Herstellung eines Mikroskop-Objekttragers

Ein gemaB Beispiel 1 hergestelltes Substrat 2 mit ei- 15
ner benutzbaren Flache von 10 mm x 10 mm wird, wie
in Fig. 10 gezeigt, mit zwei Glasobjekttragerplattchen 1,
Justierscheiben 3 und Zwischenscheiben 4, die Thermo-
statisierungs- und Nahrlosungskanale 5 enthalten, zu ei-
nem Objekttrager vereinigt. 20

Die auBeren Kanale dienen der Thermostatisierung;
uber die mittleren Kanale wird Nahrlosung zu- und ab-
geleitet.

Beispiel 3 25
Herstellung eines weiteren Mikroskop-Objekttragers

Der Mikroskop-Objekttrager besteht aus zwei nahe-
zu identischen Zwischenscheiben 10, 1 1. zwischen denen 30
ein gemaB Beispiel 1 hergestelltes Substrat 2 fliissig-
keitsdicht eingespannt werden kann. Die obere 10 und
untere 1 1 Zwischenscheibe sind bis auf den Unterschied
identisch, daB die obere seitlich vier Bohrungen 12 und
die untere an den entsprechenden Stellen vier Gewinde
(nicht dargestellt) enthalt, durch die mittels Schrauben
das dazwischenliegende Substrat 2 eingeklemmt wird.
Die Zwischenscheiben sind aus Messing gefertigt und
oberflachlich durch eine galvanisch aufgebrachte
Schicht aus Rhodium fur die Gewebekultur veredelt.
Die jeweilige AuBenflache ist mit einer rechteckigen
Einfrasung der Breite versehen, daB sie ein handelsiibli-
ches Mikroskop-Objekttragerplattchen 14 aufnehmen
kann, das durch jeweils zwei an den kurzen AuBenkan-
ten befindliche Kunststoffschrauben (in den Bohrungen
15) arretiert wird. Die Zwischenscheiben sind mit einer
zentralen Bohrung 16 versehen, durch die eine optische
Beobachtung der ZeHen im Substrat moglich ist

Auf der Innenseite befindet sich eine kreisformige
Einfrasung 20, die der paBgenauen Aufnahme des Sub-
strats dient.

Zwei auBere durchgehende Rohre 17 (Innendurch-
messer 3 mm, AuBendurchmesser 4 mm) konnen iiber
den AnschluB an ein externes Wasserbad mit Warmwas-
ser zur Temperierung durchstromt werden. Mittlere
Rohre 18, 19 ragen von gegenuberliegenden Seiten in
die zentrale Bohrung 16 hinein. Durch diese wird fri-
sches Nahrmedium durch den Hohlraum geleitet, der an
der mittleren Flache durch das Substrat 2 und an der
auBeren Flache durch das jeweilige Objekttragerplatt-
chen 14 begrenzt ist. Dadurch entstehen im zusammen-
gebauten Zustand zwei Hohlraume, die von unter-
schiedlichen Nahrmedien durchstromt werden konnen.

Das gesamte System ist somit von oben nach unten
symmetrisch durch die folgenden Komponenten aufge-
baut:

Objekttragerplattchen 14, verschraubt an die obere
Zwischenscheibe 10, verschraubt unter Zwischenlage

379 Al

6

des Substrats mit der unteren Zwischenscheibe 11, an
der ein weiteres Objekttragerplattchen 14' verschraubt
ist.

Mit den gemaB Beispiel 1 hergestelhen Substraten
wurden im folgenden biologische Versuche durchge-
fiihrt, urn die Kultivierung dreidimensionaler Zellkultu-
ren zu demonstrieren.

Beispiel 4

Beschickung des Substrats mit Zellen

Die Experimente wurden mit zwei permanenten Zell-
linien der Maus durchgefuhrt: L- und SV40-3T3-Zellen.
Es kamen durchweg Standard-Kulturmedien zum Ein-
satz.

Zunachst wurden die Substrate durch Co-Gammabe-
strahlung mit ca. 100 Gy sterilisiert und in eine trockene
Petrischaie uberfiihrt. Auf die 1 cm 2 groBe Gitterflache
wurden 300 bis maximal 400 u.1 einer konzentrierten
Suspension von Zellen bzw. Spnaroiden (Zellaggregate)
aufgetragen. Durch die Kapillarwirkung kam es zu ei-
nem raschen Eindringen in die Vertiefungen des Sub-
strats innerhalb von ca. einer Minute unter vollstandiger
Mitnahme der Zellen oder Spharoide. Nach ca. 15 Minu-
ten im Brutschrank bei 37° C wurde die Petrischaie vor-
sichtig mil Medium gefiillt, wobei zwei Varianten er-
probt wurden. Einmal wurde die Gitterstruktur unter-
schichtet, so daB sie auf dem Mediumfilm schwamm.
Alternativ wurde sie uberschichtet. In beiden Fallen eta-
blierte sich ein vollstandiger Kontakt des Mediums mit
den Zellen im Substrat; beide Varianten erwiesen sich
als gleichwertig in Bezug auf die weitere Kultivierung
der Zellen im Brutschrank. Die Beschickung des Sub-
35 strats ist insgesamt problemlos; auf eine zusatzliche vor-
sichtige Zentrifugierung zur Verbesserung des Eindrin-
gens der Zellen bzw. Spharoide kann im allgemeinen
verzichtet werden.

40 Beispiel 5

Zur Gewebefreundlichkeit des verwendeten
Kunststoffs PMMA

45 Ein weiteres Testziel bestand in der Untersuchung
der Gewebefreundlichkeit des Substratmaterials. Als
JCriterium wurde hier die Ausbildung von mikrosko-
pisch sichtbaren Kontakten mit den Wanden herange-
zogen. Es zeigte sich, daB es innerhalb weniger Stunden
50 zur Anheftung der Zellen an den Wanden der Vertiefun-
gen des Substrats kommt. Zusammen mit Vitalitatstests
und weiteren Details der Zellwechselwirkung mit den
Gitterwanden wird damit die Gewebevertraglichkeit
des Substratmaterials PMMA und der Geometrie der
55 Substratstruktur demonstriert. Die beobachtete hohe
Affinitat der Zellen zum Material wird moglicherweise
durch die Vorbestrahlung zur Sterilisierung begunstigt.
Die hierbei auftretenden Oberflachenveranderungen
(Veranderung des Ladungsmusters) konnen die Ausbil-
60 dung von Zellkontakten erleichtern.

Beispiel 6

Vitalitat und Wachstumsverhalten der Zellen

65

Das Testziel bestand zum einen darin, etwaige zell-
schadigende Wirkungen bei der Langzeitkultur im Sub-
strat zu identifizieren. Zum andern sollte das Wechsel-

DE 41 32

7

wirkungsmuster der Zellen mit den Gitterwanden und
ihre morphologische Differenzierung untersucht wer-
den. Urn zellschadigende Wirkungen zu identifizieren,
wurden Zellen und Spharoide in den Gitterstrukturen
tiber mehr als 2 Wochen kultiviert. Die Nahrstoffversor- 5
gung erfolgte durch Mediumwechsel alle 2 bis 3 Tage.
Wahrend dieser Zeit blieb die Kultur steril, die Zellen
lebens- und teilungsfahig. Beim Abbruch der Versuchs-
reihen waren noch alle Zellen vital (Nachweis durch
Trypanblau-AusschluBtest) und teilungsfahig (Klonoge- 10
nitatstest). Von dem Kultursystem gehen damit, selbst
bei Langzeitkultur, keinerlei zellschadigende Wirkun-
gen aus.

Zur Herstellung und Kultur mehrlagiger Zellschich-
ten in den Vertiefungen des Substrats kann man von 15
Einzelzellen oder bereits fertigen Spharoiden ausgehen.
Die Wahl wird in der Praxis nach den Eigenschaften der
verwendeten Zellarten, z. B. nach ihrer proliferativen
Kapazitat, getroffen.

Bei der Einbringung von Einzelzellen kommt es zu- 20
nachst zur Anheftung an die Wande der Vertiefungen
und zwar meist selektiv etwa in der Mitte der Wande,
d. h. auf halber Wandhohe. Eine Besiedlung des pordsen
Bodens der Vertiefungen findet nur in geringem Urn-
fang statt. Von den Wanden ausgehend vermehren sich 25
die Zellen ohne mechanische Unterstutzung zur Mitte
der Vertiefungen hin. Es entsteht ein mehrlagiges dich-
tes Zellgeflecht. Dieses Verhalten hangt in gewissem
Umfang vom Typus der eingesetzten Zellen ab und war
bei den L-Fibroblasten besonders ausgepragt. 30

Zur Untersuchung des Verhaltens von Spharoiden
wurden die Vertiefungen mit SV40-3T3-Spharoiden mit
einem mittleren Durchmesser von 200 u,m beschickt. Sie
waren damit kleiner als die Vertiefungen, so daB ihr
Wachstumsverhalten verfolgt werden konnte. Sie lager- 35
ten sich zunachst jeweils an eine Wand der Vertiefungen
an. Die Zellvermehrung fuhrte zu einer Volumenzunah-
me der Spharoide, so daB diese nach wenigen Tagen die
Vertiefungen randdicht ausfullten. Die Kontaktbildung
der auBeren Spharoidzellen mit den Substratwanden 40
und damit die Ausbildung eines mehrschichtigen gewe-
beartigen Zellverbands konnte mikroskopisch nachge-
wiesen und verfolgt werden.

379 Al

8

und deren Tiefe jeweils ein Mehrfaches des Durch-
messers der Zellen oder Zellaggregate betragt und
die an ihrem Grund jeweils mindestens eine Off-
nung aufweisen, die kleiner ist als die kleinste der
von den Vertiefungen aufzunehmenden Zellen
oder Zellaggregaten.

2. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich-
net, daB die Stege ein Gitter mit pyramidenstumpf-
formigen Vertiefungen bilden.

3. Substrat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge-
kennzeichnet, daB der plattenformige Korper aus
einem Gitter mit zur Gitterebene senkrechten oder
geneigten Stegen aufgebaut ist, das auf eine mikro-
porose Bodenplatte aufgesetzt ist.

4. Substrat nach Anspruch 3, dadurch gekennzeich-
net. daB die Bodenplatte losbar mit dem Gitter ver-
bunden ist.

5. Substrat nach einem der Anspruche 2 bis 4, da-
durch gekennzeichnet, daB das Gitter aus einem
durchsichtigen Material hergestellt ist.

6. Substrat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeich-
net, daB das durchsichtige Material Polymethylme-
thacrylat(PMMA)darstellt.

7. Substrat nach Anspruch 5 oder 6, dadurch ge-
kennzeichnet, daB das Gitter einen Teil eines Mi-
kroskop-Objekttragers darstellt oder als Mikro-
skop-Objekttrager ausgebildet ist.

8. Dreidimensionale Kultur von Zellen oder Zellag-
gregaten mit einem Substrat in Form einer Gitter-
struktur mit wabenartig angeordneten, durch Stege
mit zur Gitterebene senkrechten oder geneigten
Wanden getrennten Durchbruchen, deren Durch-
messer und Tiefe ein Mehrfaches des Durchmes-
sers der Zelle oder Zellaggregate betragt, wobei
die Zellen oder Zellaggregaten an den Wanden der
Stege haften.

Hierzu 7 Seite(n)Zeichnungen

Beispiel 7 45

Ablosung der Zellen zur Analyse;
Wiederverwendbarkeit der Substrate

Die in den Vertiefungen verankerten Zellen kdnnen 50
mit Hilfe einer enzymatischen Behandlung mit Trypsin
herausgelost und weiter analysiert werden. Die lichtmi-
kroskopische Inspektion zeigt, daB die Zellen dabei
quantitativ aus den Vertiefungen enlfernt werden. Auch
eine einwochige Inkubation des geleerten Substrats mit 55
frischem Kulturmedium ergab, daB keine Zellen in den
Vertiefungen verblieben. Gleichzeitig konnte damit die
Aufrechterhaltung der Sterilitat dokumentiert werden.
Auf diese Art "gereinigte" Substrate sind wiederholt ein-
setzbar. 6Q

Patentanspruche

1. Substrat fur Zellkulturen, bestehend aus einem
mikrostrukturierten plattenformigen Korper, der 65
zur Aufnahme von Zellen oder Zellaggregaten eine
Vielzahl von durch Stege voneinander getrennte
Vertiefungen enthalt, deren groBter Durchmesser

ZEICHNUNGEN SEITE 1

Nummer:
Int. CI. 5 :

Offenlegungstag:

DE 41 32 379 A1
C12M 3/00

8. April 1993

Fig. 1

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Fig 2

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ZEICHNUNGEN SEITE 2

Nummer: DE41 32 379 A1

Int.CI. 5 : C12M 3/00

Offenlegungstag: 8. April 1993

Fig. 3

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308014/115

ZEICHNUNGEN SEITE 3

Nummer:
Int. CI. 5 :

Offenlegungstag:

DE 41 32 379 A1
C12M 3/00

8. April 1993

Fig. M

Fig. 5

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308 014/115

ZEICHNUNGEN SEITE 4

Nummer: DE 41 32 379 A1

Int. CI. 6 : C12M 3/00

Off enlegungstag: 8. April 1 993

Fig. 6

308014/115

ZEICHNUNGEN SEITE 5

Nummer:
Int. CI. 6 :

Offenlegungstag:

DE 41 32 379 A1
C12M 3/00

8. April 1993

Fig. 8

Fig. 9

308 014/115

ZEICHNUNGEN SEITE 8

Nummer: DE 41 32 379 A1

Int. CI. 5 : C12M 3/00

Often leg ungstag: 8. April 1993

308 014/115

ZEICHNUNGEN SEITE 7

Fig. 11

15

15

Schnitt A-B

Nummer: DE 41 32 379 A1

Int. CI. 6 : C12M 3/00

Offenlegungstag: 8. April 1993

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